ترانسفکشن رده سلولی PC12 بوسیله وکتور بیانی -NT4 pEGFPNIو بررسی بیان پروتئینی آن

سابقه و هدف: یکی از تکنیک‌های پایه‌ای مهم برای مطالعه یک پروتئین اختصاصی در بیولوژی مولکولی، کلون کردن و بیان آن در سلول می‌باشد. از جمله روشهای منتقل کردن ژن، روشهای غیر ویروسی است که کم‌هزینه‌تر، آسانتر و ایمنتر می‌باشند. یکی از ژن‌های مهم که کاربردهای بالینی فراوانی دارد ژن NT4 است. این ژن یکی از اعضای خانواده نوروتروفیک است و در سلول‌های گلیال سیستم اعصاب محیطی و مرکزی بیان می‌شود. این نوروتروفین در بیان ژنی، بقا و تمایز رده‌های مختلف نورونی شرکت دارد. هدف از انجام این پژوهش، ساب‌کلونینگ و ترانسفکت این ژن به منظور مطالعه و دسترسی بیشتر با توجه به نیاز به این فاکتور نوروتروفیک در فعالیتهای ژن درمانی است. مواد و روشها: در این تحقیق، ژن NT4 با روش PCR در پلاسمید pCMV-SPORT6کلون گشته و پس از آن در باکتری اشرشیاکلی سوش DH5-α ترانسفورم شد. پلاسمید نوترکیب از باکتری میزبان استخراج و ژنNT4 با استفاده از آنزیم Not I ,Sal Iاز پلاسمید جدا گردید. در مرحله بعد پلاسمید برای پذیرش قطعه NT4 و انجام کلونینگ با آنزیم Hind III برش داده شد و ژن NT4 درون پلاسمید pEGFP-NI ساب‌کلون شد. محصول واکنش اتصال در باکتری فوق ترانسفورم و در محیط LB حاوی آمپی‌سیلین کشت داده شد. پلاسمیدهای نوترکیب با استفاده از کیت استخراج پلاسمید، از باکتری تخلیص و در مرحله بعد در سلول PC12 ترانسفکت گردید و در خاتمه بیان پلاسمید نوترکیبب با روشSDS PAGE ,western blotting مورد بررسی قرار گرفت. یافته‌ها: آنالیز آنزیمی و تعیین توالی نشان داد پلاسمید ژن مورد نظر حاوی توالی صحیحی بوده و تطابق کامل با توالی ژن مورد نظر در بانک ژن دارد. در آنالیز پروتئین‌های جدا شده از سلول‌های ترانسفکت شده با روش SDS-PAGE، باندی حدود 45 کیلودالتون مشاهده شد که با آنتی‌بادی مونوکلونال در آنالیز وسترن بلات مورد تأیید قرار گرفت. نتیجه‌گیری: این پلاسمید به دلیل ساختار صحیح، جهت انتقال به سیستم یوکاریوتی و ارزیابی بیان مناسب می‌باشد.